【药渡说】HCV药物研发进展综述(三)：NS5A抑制剂竞品分析
本期内容概要：
NS5A蛋白的结构与功能
NS5A抑制剂研究策略
NS5A抑制剂上市药物介绍
NS5A抑制剂国内研发情况
NS5A抑制剂研究现状与分析
导读：
上一期我们详细的介绍了NS3/4A蛋白酶与NS3/4A蛋白酶抑制剂，了解到NS3/4A蛋白酶抑制剂是最早上市的丙肝特异的直接抗病毒药物(DAAs) 。DAA 主要包括 NS3/4A 蛋白酶抑制剂、 NS5A 抑制剂及NS5B 聚合酶抑制剂。
2011 年批准上市的NS3/4A蛋白酶抑制剂与 SOC 联用后，成为HCV基因型1型患者干扰素/利巴韦林治疗未完全根除后的推荐疗法。而2014年批准上市的NS5A抑制剂，联合利巴韦林等治疗方案对基因 1-4型 HCV 感染者有显著治疗效果。
本期我们将详细探讨非结构蛋白NS5A及其抑制剂的研发与现状。
NS5A蛋白酶结构与功能
HCV基因组中非结构基因编码HCV NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B等非结构蛋白。HCV特异的直接抗病毒药物DAAs主要包括 NS3/4A 蛋白酶抑制剂、 NS5A 抑制剂及NS5B 聚合酶抑制剂。(图1)
图 1 HCV病毒基因组构成（Asselah T., 2011）
NS5A是一种高度磷酸化的非结构蛋白，不具备酶催化活性，其磷酸化水平在HCV基因组的复制和翻译过程中也起着调节的作用。
NS5A构成
NS5A非结构蛋白含有 447 个氨基酸，分子量为 58 kDa，有3个不同的结构域。结构域I(氨基酸序列: 1-213)由一个高度保守的两性α-螺旋和一个疏水的侧链及带电的侧链组成，是NS5A与RNA 结合的重要区域。其晶体结构(图2)显示它是一个二聚体，有一个包含四个半胱氨酸残基(Cys39、Cys57、Cys59、Cys80)的锌结合区域，此区域对蛋白的稳定性起着重要作用。参与 HCV 复制，主要由其结构域I和结构域II (氨基酸序列: 250-342)负责；参与 HCV 颗粒的装配，主要由结构域III ( 氨基酸序列：356-447)负责。
图 2 NS5A结构域示意图(Timothy L et al., 2005)
NS5A蛋白功能
NS5A上丝氨酸残基产生两种磷酸化程度不同的蛋白，即基础磷酸化p56和高度磷酸化p58，均在 HCV 的生命周期中发挥重要作用。研究发现， NS5A 可与 HCV RNA、NS5B 等组成复制复合体，完成 HCV复制； NS5A亦可通过与 NS5B 作用刺激 NS5B 合成负链 RNA。此外， NS5A 可通过其上的IFN 敏感决定区与 IFN 刺激产生 RNA 依赖型蛋白激酶结合，通过抑制其活性来调节对 IFNα 应答。
NS5A 还可通过与磷脂酰肌醇 4- 激酶Ⅲα(PI4K Ⅲ α)作用刺激其产生 HCV 复制所必需的磷脂酰肌醇 4- 磷酸 (PI4P)。（图3）
图 3 NS5A蛋白作用示意图
即使NS5A无已知的酶活性，它与膜网结构相互作用对病毒复制，和修饰/缺失膜-结合AH结构域的特异性残基损害ER定位和RNA复制两方面是至关重要的。(图4)
图 4 HCV病毒颗粒组装示意图(Suzuki T., 2012)
NS5A抑制剂研究策略
NS5A功能的重要性和多样性使它成为抗HCV的重要靶点，NS5A 抑制剂的作用机制不局限于一种，可能是多种机制的综合。(图5)
NS5A抑制剂作用机制的研究可简要分为：
抑制NS5A高度磷酸化；
抑制NS5A两性α-螺旋；
抑制NS5A结构域I、II、III；
干扰NS5A从内质网向脂滴转移，导致 NS5A 不能装配到复制复合体中，从而抑制具有完整功能的复制复合体形成和 HCV 复制；
与NS5A形成的功能复合物结合，在改变NS5A 构象的基础上通过协同变构作用使整个功能复合物失效，从而抑制 HCV。
图 5 NS5A 抑制作用 (Ascher, D. B., 2014)
NS5A抑制剂上市药物介绍
与 NS3/4A 和 NS5B 不同，NS5A 不具有酶活性，因此无法在酶学水平上筛选 NS5A 抑制剂，而只能在细胞水平上进行。
下表为已上市的NS5A蛋白酶抑制剂列表：
NS5A抑制剂- Daclatasvir
Daclatasvir是第一代HCV复制复合物的NS5A抑制剂，通过修饰高通量筛选获得的活性化合物，为一日 1 次口服用药，且口服生物利用度高。作用机制见图6
Daclatasvir联合 SOC 的治疗方案主要针对基因1-4 型 HCV 感染，与传统的 SOC 相比，该方案可提高患者的持续病毒响应时间(SVR) 获得率且缩短治疗周期。初次接受治疗的基因 1、2、3 和 4 型 HCV， 感染患者接收该方案治疗后，SVR12获得率分别为 83%，83% -88%， 69% -78% 和 100%。
Daclatasvir联合 Asunaprevir 和 SOC 方案主要针对基因 1 和 4 型 HCV 感染，临床上该方案的治疗效果优于特拉匹韦 (或波普瑞韦)联合 SOC。
图 6 Daclatasvir作用机制示意图
NS5A抑制剂- Ledipasvir/Sofosbuvir
Ledipasvir为一日 1 次口服给药，具有较低的血浆蛋白结合率和较高的选择性毒性。
Ledipasvir/Sofosbuvir主要针对基因 1 和 3-5 型 HCV 感染。初次接受治疗的基因 1 型 HCV 感染患者 SVR12获得率为 84%-100%。重症肝病患者和有过索菲布韦治疗失败经验的基因 1 型HCV 感染患者 SVR4获得率均为 100%，可见该方案对难治愈患者也有较好的治疗效果。在2015年， Ledipasvir/Sofosbuvir的年销售额高达138亿美元，成为抗丙肝药物中的一匹黑马。
NS5A抑制剂- Elbasvir/Grazoprevir
Elbasvir/Grazoprevir于2016年1月28日被美国FDA批准，治疗成人患者基因1和基因4型HCV感染。接受治疗的基因 1 型和基因4型HCV 感染患者 SVR 率分别为94-97%和 97-100% 。
下表列出了上述抗丙肝药物部分重要研究数据。
NS5A抑制剂国内研发情况
东阳光药业-依米他韦
东阳光药业的1.1类新药NS5A抑制剂依米他韦(Yimitasvir)项目获国家十二五新药创制重大专项资助，于2014年11月临床获批。
歌礼-ASC16
ASC16属于DAA中的HCV NS5A抑制剂，于包括HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂在内的其他抗HCV的DAA有协同或叠加作用。已在欧美完成IIa期临床研究结果显示，ASC16与包括HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂在内的其他DAA联合，组成的全口服免干扰素治疗方案具有治愈率高及安全性良好的特征，经12周治疗后，难治型HCV基因型1a患者的治愈率高达92%。
NS5A抑制剂研究现状与分析
NS5A是治疗HCV感染的新靶标，其小分子抑制剂的研究尚处于起步阶段。目前多个新化合物已经进入到临床试验阶段。
当前NS5A抑制剂的研究尚存在如下几个方面问题：
已报道的NS5A抑制剂绝大多数是通过细胞水平的高通量筛选发现的，目前缺乏蛋白水平的高效筛选方法。
NS5A与抑制剂的结合主要通过间接的突变方法测定，采用生物化学或生物物理技术建立直接的测试方法对研究构效关系和作用机制具有重要意义。
NS5A蛋白在HCV病毒不同基因型中存在序列差异，并且容易突变，所以发现具有广谱作用并且能够抵抗耐药突变的新型抑制剂仍任重而道远。
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